從二十世紀(jì)八十年代至今，世界上生產(chǎn)流式細(xì)胞儀的廠家?guī)捉?jīng)變遷，BC & BD仍在，新玩家不斷進(jìn)入，并購重組各取所需，它們生產(chǎn)各種不同性能和功能的流式細(xì)胞儀。總體而言，呈現(xiàn)出以下的發(fā)展趨勢：

　　1. 應(yīng)用對象從細(xì)胞到顆粒

　　一般而言，流式細(xì)胞儀檢測的對象是細(xì)胞，而且是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞，即單細(xì)胞懸液。組織和器官中的細(xì)胞，bi須用各種方法制備成單細(xì)胞懸液，才能進(jìn)行檢測。

　　細(xì)菌、浮游生物等也可以用流式細(xì)胞儀分析。

　　一些不是細(xì)胞的單個粒子，如病毒、細(xì)胞核、染色體、原生質(zhì)體等也是流式細(xì)胞儀的檢測對象。實(shí)際上，用“顆?！倍粌H僅是“細(xì)胞”來定義流式細(xì)胞儀的檢測對象，顯然更有代表意義。

　　因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀可以將“顆?！币曂瑸椤凹?xì)胞”來進(jìn)行檢測，在te制的微球上包被抗原，抗體或核酸探針，以微球?yàn)檩d體來檢測各種可溶性蛋白、細(xì)胞因子、自身抗體、特定的核酸序列等，從而使流式細(xì)胞儀的檢測對象擴(kuò)展到分子范圍。

　　Luminex公司的多重流式檢測平臺能夠自一個微量反應(yīng)孔中同時檢測50、100甚至多達(dá)500種分析物，儼然成為這一技術(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)。

　　2. 檢測顆粒尺度大大拓寬

　　常規(guī)流式細(xì)胞儀檢測顆粒的范圍為0.5-50μm。

　　電荷分選流式細(xì)胞儀檢測顆粒范圍與噴嘴直徑等相關(guān)，zui大應(yīng)到噴嘴直徑的1/3-1/2，目前zui大直徑的噴嘴為200μm。

　　Union Biometrica公司的氣流分選平臺COPAS FP和BioSorter能夠適應(yīng)大到1500μm的顆粒，可以用于分選模式動物的卵和幼蟲;模式植物種子與花粉;大體積細(xì)胞與細(xì)胞簇等。CytoBuoy公司的Cytosense也可以到1500μm?！　?/p>

Union Biometrica公司氣流分選流式原理圖

　　通過光路優(yōu)化，采用多角度光散射，使用特殊熒光探針，甚至加裝紫色激光收集散射光信號，有些流式細(xì)胞儀可以實(shí)現(xiàn)0.2μm顆粒與噪音信號的鑒別。

　　Apogee著力于微顆粒分析，其A50-Micro plus散射光的檢測低限至80nm，可用于循環(huán)微粒，外泌體及特殊微生物檢測。

02.jpg

Apogee A50-Micro plus

　　3.多種流路技術(shù)商品化

　　絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀基于鞘液流體動力學(xué)模式。

　　因?yàn)樨?fù)壓進(jìn)樣省去了龐大的壓縮氣源，可以靈活使用各種上樣管，已經(jīng)成為幾乎所有公司新儀器的選擇。

　　一般認(rèn)為，流式細(xì)胞儀采用毛細(xì)管而非鞘液，容易被大的細(xì)胞或聚集細(xì)胞所阻塞，而且流動細(xì)胞難以準(zhǔn)確聚焦，流速難以維持恒定。

　　Guava平臺easyCyte(現(xiàn)被Luminex公司收購)通過負(fù)壓進(jìn)樣，采用高壓注射泵與PEEK管路，建立自穩(wěn)流的微毛細(xì)管系統(tǒng)，據(jù)稱解決了以上困擾，帶來的好處是無需鞘液，產(chǎn)生廢液也少。

Guava easyCyte(Luminex)

　　Thermo公司聲波流式細(xì)胞儀Attune NxT ，該產(chǎn)品利用chao聲波將細(xì)胞聚集在樣品流中軸線上。進(jìn)樣速度至1mL/min時，也可以避免基于鞘液的流式的所謂軸流加寬和細(xì)胞分散現(xiàn)象，這一技術(shù)的zui大優(yōu)勢是快速檢測，同時對xi有細(xì)胞的分析比較有利。

Thermo Attune NxT

　　4.從相對計(jì)數(shù)到直接jue對計(jì)數(shù)

　　為滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，流式細(xì)胞儀必須采集一定數(shù)量的細(xì)胞，儀器設(shè)定以細(xì)胞數(shù)為停止條件。傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀測試結(jié)果為相對計(jì)數(shù)，即目標(biāo)細(xì)胞在某一總體系中的比值。

　　隨著應(yīng)用深入，人們發(fā)現(xiàn)比值的變或者不變，以及變化大小不能反映細(xì)胞的真實(shí)變化，jue對計(jì)數(shù)，即單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)被證明更具實(shí)際價值。

　　zui早是采用雙平臺法來解決以上問題，即用血細(xì)胞分析儀來獲得白細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等濃度，再結(jié)合流式細(xì)胞儀測定的百分比來計(jì)算被測細(xì)胞的jue對計(jì)數(shù)值。由于該法需要使用兩種儀器，操作步驟多、變異系數(shù)大，不同實(shí)驗(yàn)室之間的差異也較大，因此應(yīng)用受到限制。

　　后來人們采用微球法，即用已知濃度的微球作為參比，通過被測細(xì)胞和微球的比例關(guān)系來進(jìn)行jue對計(jì)數(shù)，但因計(jì)數(shù)微球價格較為昂貴，實(shí)際應(yīng)用受到限制。

　　近年來，廠家的共識回到了測定進(jìn)樣體積這一思路上來，替代微球法直接進(jìn)行jue對計(jì)數(shù)，取得更為Jin確的結(jié)果。區(qū)別在于不同產(chǎn)品具體測定技術(shù)的差別。

　　蠕動泵：Accuri C6 Plus、CytoFlex

　　注射泵：easyCyte、NovoCyte、CytoFlow

　　流量傳感器：FACSVerse、Bricyte E6

Sysmex CytoFlow系列TVAC體積測定原理

　　5.光路優(yōu)化和光學(xué)新元件的應(yīng)用

　　龐大的水冷或氣冷的激光器逐漸被小型化的固態(tài)激光器取代。

　　光纖傳導(dǎo)應(yīng)用越來越普遍。

　　光纖耦合讓光能量傳輸更gao效，而不為公司所專有。

　　雪崩光電二極管等等新檢測器提供新的選擇。請見專家分析：

　　流式細(xì)胞儀是怎么“看見”光的?

　　以及光學(xué)元件的神級組合讓靈敏度達(dá)到新的高度。

　　MESF是儀器靈敏度衡量的標(biāo)準(zhǔn)，基于微球，基于鞘液。

　　不同公司沒有約定俗成，不是那么容易比較，但就同一公司產(chǎn)品而言：

　　BD FACSCelesta FITC 25 PE 15

　　Beckman Coulter CytoFlex FITC 30 PE 10

　　6.以多色分析為核心的新型光學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展

　　早期流式細(xì)胞儀的主要應(yīng)用還是細(xì)胞DNA含量測定，這一技術(shù)對設(shè)備要求不高，通常配備一個散射光和一個熒光信號的流式細(xì)胞儀就足以應(yīng)付。隨著新型熒光探針的不斷開發(fā)和儀器軟、硬件的逐步更新，流式細(xì)胞儀多色熒光分析得到了迅速發(fā)展，包括兩個方面：

　　單激光多色，如488nm激光同時激發(fā)7色，紫色激光同時激發(fā)10色

　　多激光：如10激光機(jī)器。

　　也包括兩種新的光學(xué)設(shè)計(jì)機(jī)型：

　　光譜流式，利用特殊的接受裝置收集某范圍內(nèi)的全發(fā)射光譜，無需補(bǔ)償，區(qū)別發(fā)射光譜重合度高的熒光染料對。目前有Sony公司SP6800Z和SA3800，Cytek公司的Aurora。

　　質(zhì)譜流式，利用質(zhì)譜原理對單細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)檢測的流式技術(shù)。這個名為CyTOF的平臺ui初由DVS Sciences公司開發(fā)，后被Fluidigm公司收購。儀器采用同位素標(biāo)記抗體來標(biāo)記或識別細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子，并根據(jù)流式細(xì)胞原理分離單個細(xì)胞，再用感應(yīng)耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)觀察單個細(xì)胞的原子質(zhì)量譜，zui后將原子質(zhì)量譜的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞表面和內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)。2015年推出的Helios的檢測通道達(dá)到135個，幾乎沒有信號重疊或背景噪音。